Rekombinantna dna: opis, karakteristike

Rekombinantna DNA su molekule nastale laboratorijskim tehnikama genetske rekombinacije za kombiniranje genetskog materijala iz više izvora. Moguće je jer molekule DNA svih organizama imaju istu kemijsku strukturu i razlikuju se samo u nukleotidnom slijedu unutar svojih granica.

Stvaranje

Molekularno kloniranje je laboratorijski postupak koji se koristi za stvaranje rekombinantne DNA. To je jedna od dvije najčešće korištene metode, zajedno s lančanom reakcijom polimeraze (PCR). Omogućuje kontrolu replikacije bilo koje određene sekvence DNA koju je eksperimentator odabrao.

Postoje dvije temeljne razlike između metoda rekombinantne DNA. Jedan je da molekularno kloniranje uključuje replikaciju u živoj stanici, dok PCR uključuje in vitro. Druga je razlika u tome što prva metoda omogućuje rezanje i lijepljenje DNA sekvenci, dok se druga pojačava kopiranjem postojećeg slijeda.

Vektor DNA

Za dobivanje rekombinantne DNA potreban je vektor kloniranja. Potječe od plazmida ili virusa i relativno je mali segment. Izbor vektora za molekularno kloniranje ovisi o izboru organizma domaćina, veličini klonirane DNA i o tome trebaju li se strane molekule izraziti. Segmenti se mogu kombinirati pomoću različitih metoda, poput kloniranja restrikcijske / ligaze ili Gibsonovih sklopova.

Kloniranje

U standardnim protokolima kloniranje uključuje sedam koraka.

1. Odabir organizma domaćina i vektora kloniranja.
2. Dobivanje DNA vektora.
3. Formiranje klonirane DNA.
4. Stvaranje rekombinantne DNA.
5. Uvođenje u tijelo domaćina.
6. Odabir organizama koji ga sadrže.
7. Odabir klonova sa željenim umetcima DNA i biološkim svojstvima.

Nakon transplantacije u organizam domaćina, strane molekule sadržane u rekombinantnoj konstrukciji mogu se ili ne eksprimirati. Ekspresija zahtijeva restrukturiranje gena kako bi se uključile sekvence koje su potrebne za proizvodnju DNA. Koristi ga prevoditeljski aparat domaćina.

Kako djeluje

Rekombinantna DNA djeluje kada stanica domaćin eksprimira protein iz rekombinantnih gena. Ekspresija ovisi o okruženju gena skupom signala koji daju upute za njegovu transkripciju. Oni uključuju promotor, vezanje ribosoma i Terminator.

Problemi nastaju ako gen sadrži introne ili signale koji djeluju kao Terminatori za bakterijskog domaćina. To dovodi do preranog prestanka. Rekombinantni protein može se nepravilno obraditi, smotati ili razgraditi. Njegova proizvodnja u eukariotskim sustavima obično se odvija u kvascima i nitastim gljivama. Korištenje životinjskih stanica teško je zbog činjenice da mnogi trebaju čvrstu potpornu površinu.

Svojstva organizama

Organizmi koji sadrže rekombinantne molekule DNA imaju očito normalne fenotipove. Njihov izgled, ponašanje i metabolizam obično se ne mijenjaju. Jedini način da se dokaže prisutnost rekombinantnih sekvenci je ispitivanje same DNA pomoću testa lančane reakcije polimeraze.

U nekim slučajevima rekombinantna DNA može imati štetne učinke. To se može dogoditi kada se njegov fragment koji sadrži aktivni promotor nalazi u blizini prethodno Tihog gena stanice domaćina.

Upotreba

Tehnologija rekombinantne DNA široko se koristi u biotehnologiji, medicini i istraživanju. Njezini proteini i drugi proizvodi mogu se naći u gotovo svakoj zapadnoj ljekarni, veterinarskoj klinici, liječničkoj ordinaciji, medicinskom ili biološkom laboratoriju.

Najčešća primjena je osnovno istraživanje u kojem je tehnologija važna za većinu suvremenih radova u biološkim i biomedicinskim znanostima. Rekombinantna DNA koristi se za identifikaciju, mapiranje i sekvenciranje gena te za određivanje njihove funkcije. Sonde rDNA koriste se za analizu ekspresije gena u pojedinačnim stanicama i u tkivima cijelih organizama. Rekombinantni proteini koriste se kao reagensi u laboratorijskim eksperimentima. U nastavku su navedeni neki konkretni primjeri.

Rekombinantni kimozin

Pronađen u abomasumu, kimozin je enzim, potreban za proizvodnja sira. Bio je to prvi genetski modificirani dodatak prehrani koji se koristi u industriji. Mikrobiološki proizvedeni rekombinantni enzim, strukturno identičan onom dobivenom od teleta, košta manje i proizvodi se u velikim količinama.

Rekombinantni humani inzulin

Gotovo u potpunosti zamijenio inzulin dobiven iz životinjskih izvora (poput svinja i goveda) za liječenje dijabetesa ovisnog o inzulinu. Rekombinantni inzulin sintetizira se uvođenjem gena humanog inzulina u bakterije roda eterihij ili kvasac.

Hormon rasta

Propisuje se pacijentima kod kojih hipofiza stvara nedovoljnu količinu hormona rast za održavanje normalnog razvoja. Prije nego što je rekombinantni hormon rasta postao dostupan, dobiven je iz hipofize leševa. Ova nesigurna praksa dovela je do toga da su neki pacijenti razvili Creutzfeldt-Jakobovu bolest.

Rekombinantni faktor zgrušavanja krvi

To je protein koji zgrušava krv i daje se pacijentima s oblicima hemofilije s poremećajem krvarenja. Oni nisu u stanju proizvesti faktor u dovoljnim količinama. Prije razvoja rekombinantnog faktora, protein je dobiven preradom velike količine ljudske krvi od više davatelja. To je nosilo vrlo visok rizik od prijenosa zaraznih bolesti.

Dijagnoza HIV infekcije

Svaka od tri široko korištene metode za dijagnosticiranje HIV infekcije razvijena je pomoću rekombinantne DNA. Test antitijela koristi njezin protein. Otkriva prisutnost HIV genetskog materijala pomoću lančane reakcije polimeraze reverzne transkripcije. Razvoj testa omogućen je molekularnim kloniranjem i analizom sekvenci HIV genoma.