Rekombinantni protein: metode pripreme i primjene

Protein je bitna komponenta svih organizama. Svaka njegova molekula sastoji se od jednog ili više polipeptidnih lanaca sastavljenih od aminokiselina. Iako su informacije potrebne za život kodirane DNA ili RNA, rekombinantni proteini izvode širok raspon bioloških funkcije u organizmima, uključujući enzimsku katalizu, zaštitu, potporu, kretanje i regulaciju. Prema svojim funkcijama u tijelu, ove se tvari mogu podijeliti u različite kategorije kao što su antitijela, enzimi, strukturna komponenta. S obzirom na važne funkcije, takvi su spojevi intenzivno proučavani i široko korišteni.

U prošlosti je glavni način dobivanja rekombinantnog proteina bio izoliranje iz prirodnog izvora, što je općenito neučinkovito i dugotrajno. Nedavni napredak u biološkoj tehnologiji molekula omogućio je kloniranje DNA koja kodira određeni skup tvari u ekspresijski vektor tvari kao što su bakterije, kvasci, stanice insekata i stanice sisavaca.

Jednostavno rečeno, rekombinantni proteini prevode se produktima egzogene DNA u živim stanicama. Njihovo dobivanje obično sadrži dva glavna koraka:

1. Kloniranje molekule.
2. Ekspresija proteina.

Trenutno je proizvodnja takve strukture jedna od najmoćnijih tehnika koja se koristi u medicini i biologiji. Sastav ima široku primjenu u istraživanju i biotehnologiji.

Medicinski smjer

Rekombinantni proteini pružaju važne metode liječenja razne bolesti poput dijabetesa, raka, zaraznih bolesti, hemofilije i anemije. Uobičajene formulacije takvih tvari uključuju antitijela, hormone, interleukine, enzime i antikoagulanse. Sve je veća potreba za rekombinantnim formulacijama za terapijsku primjenu. Omogućuju vam proširenje metoda liječenja.

genetski modificirani rekombinantni proteini igraju ključnu ulogu na tržištu terapijskih lijekova. Trenutno se najviše terapijskih tvari proizvodi u stanicama sisavaca, jer su njihove formulacije sposobne proizvesti visokokvalitetne tvari slične prirodnim. Uz to, mnogi odobreni rekombinantni terapijski proteini proizvode se u E. coli zbog dobre genetike, brzog rasta i visoko produktivne proizvodnje. Također ima pozitivan učinak u razvoju lijekova na temelju ove tvari.

Provođenje istraživanja

Priprema rekombinantnih proteina temelji se na različitim metodama. Tvari pomažu razjasniti osnovne i temeljne principe tijela. Te se molekule mogu koristiti za identifikaciju i lociranje tvari kodirane određenim genom i za otkrivanje funkcije drugih gena u različitim staničnim aktivnostima kao što su stanična signalizacija, metabolizam, rast, replikacija i smrt, transkripcija, prijevod i modifikacija sastava koji se razmatraju u članku.

Stoga se pregledani sastav često koristi u molekularnoj biologiji, staničnoj biologiji, biokemiji, strukturnim i biofizičkim istraživanjima i mnogim drugim područjima znanosti. Štoviše, proizvodnja rekombinantnih proteina ima međunarodnu praksu.

Takve formulacije su korisni alati u razumijevanju interakcija stanica-stanica. Pokazali su se učinkovitima u nekoliko laboratorijskih tehnika, kao što su ELISA i imunohistokemija (IPO). Rekombinantni proteini mogu se koristiti za razvoj enzimskih testova. Kada se koriste u kombinaciji s parom odgovarajućih antitijela, stanice se mogu primijeniti kao standardi za primjenu novih tehnologija.

Biotehnologija

Rekombinantni proteini koji sadrže aminokiselinsku sekvencu također se koriste u industriji, proizvodnji hrane, poljoprivredi i bioinženjeringu. Na primjer, u stočarstvu se enzimi mogu dodati hrani kako bi se povećala hranjiva vrijednost sastojaka hrane za životinje, smanjili troškovi i otpad, podržali zdravlje crijeva životinja, poboljšati performanse i poboljšati okoliš.

Uz to, bakterije mliječne kiseline (Lab) već se dugo koriste za proizvodnju fermentirane hrane, a nedavno je lab razvijen za ekspresiju rekombinantnih proteina koji sadrže aminokiselinsku sekvencu, a koji mogu imati široku primjenu, na primjer, za poboljšanje probave ljudi, životinja i prehrane.

Međutim, takve tvari također imaju ograničenja:

1. U nekim je slučajevima proizvodnja rekombinantnih proteina složena, skupa i dugotrajna.
2. Tvari proizvedene u stanicama možda se ne podudaraju s prirodnim oblicima. Ova razlika može smanjiti učinkovitost terapijskih rekombinantnih proteina, pa čak i uzrokovati nuspojave. Osim toga, ova razlika može utjecati na rezultate eksperimenata.
3. Glavni problem svih rekombinantnih lijekova je imunogenost. Svi biotehnološki lijekovi mogu pokazati neki oblik imunogenosti. Teško je predvidjeti sigurnost novih terapijskih proteina.

Sveukupno, napredak u biotehnologiji povećao je i promovirao proizvodnju rekombinantnih proteina za različite primjene. Iako još uvijek imaju neke nedostatke, tvari su važne u medicini, istraživanju i biotehnologiji.

Povezanost s bolestima

rekombinantni protein nije štetan za ljude. To je samo sastavni dio ukupne molekule u razvoju određenog lijeka ili elementa prehrane. Mnoga medicinska istraživanja pokazala su da je prisilna ekspresija proteina AMAPI3 (skraćeno AMAPI3) u laboratorijskom soju pretilih miševa pokazala značajno smanjenje njihove masne mase, unatoč genetskoj predispoziciji za konzumaciju.

Rezultati takvih iskustava sugeriraju da bi protein Mara 3 mogao ponuditi novu terapiju za rješavanje poremećaja povezanih s metaboličkim sindromom, poput dijabetesa tipa 2 i masne jetre. No, budući da je AZIPIN3 prirodni protein, a ne umjetni lijek, klinička ispitivanja rekombinantnog humanog azipin3 mogu započeti nakon posljednjeg kruga pretkliničkih studija. Na, to jest, razlozi koji se odnose na sigurnost takvih studija. Rekombinantni protein šteta za osoba ne nosi ni zbog postupne obrade i čišćenja. Promjene se događaju i na molekularnoj razini.

Ama-ama2, jedan od ključnih igrača u imunoterapiji koji je bio u nominaciji za Nobelovu nagradu za fiziologiju ili medicinu za 2018. godinu. Ovaj rad započeo je prof. Tasuku Honjo iz Japana, dovela je do liječenja karcinoma poput melanoma, raka pluća i drugih na temelju imunoterapije kontrolne točke. Nedavno je u svoju liniju imunoterapije dodao važan novi proizvod-aktivator ice - ice2 / ice-cho rekombinantna stanična linija.

U ekperimentima dokazanog koncepta, i traživači a Veučilišta Alabama u Birminghamu pod vodstvom dr. med.Long Zheng, profesor Robert B. Adamsa i ravnatelja Odjela za laboratorijsku medicinu na Odjelu za patologiju na Medicinskom fakultetu ISA, istakli su potencijalnu terapiju rijetkog, ali smrtonosnog poremećaja krvarenja, Isa.

Rezultati ove studije po prvi put pokazuju da transfuzija trombocita opterećenih AIMP 13 može biti novi i potencijalno učinkovit terapijski pristup arterijskoj trombozi povezanoj s urođenim i imuno posredovanim AIMP-om.

Rekombinantni protein nije samo hranjiva tvar, već i lijek u formulaciji koja se razvija. To nisu samo mnoga područja koja su sada uključena u medicinu i koja se odnose na proučavanje svih njezinih strukturnih elemenata. Kao što pokazuje međunarodna praksa, struktura tvari omogućuje na molekularnoj razini borbu protiv mnogih ozbiljnih problema u ljudskom tijelu.

Razvoj cjepiva

Rekombinantni protein je specifičan skup molekula koje se mogu modelirati. Slično svojstvo koristi se i u razvoju cjepiva. Nova strategija cijepljenja, poznata i kao upotreba posebne rekombinantne virusne injekcije, mogla bi pružiti zaštitu milijunima pilića kojima prijeti ozbiljna respiratorna bolest, izvijestili su istraživači sa Sveučilišta u Edinburghu i Instituta Pirbright. Ova cjepiva koriste bezopasne ili slabe verzije virusa ili bakterije za uvođenje mikroba u stanice tijela. U ovom su slučaju stručnjaci koristili rekombinantne viruse s različitim proteinima šiljaka kao cjepiva za stvaranje dvije verzije bezopasnog virusa. Postoji mnogo različitih lijekovi veze izgrađene na njemu.

Rekombinantni protein trgovačka imena i analozi ima sljedeće:

1. "Fortelizin".
2. "Zaltrap".
3. "Eilea".

To su uglavnom antitumorski lijekovi, ali postoje i druga područja liječenja povezana s ovom aktivnom tvari.

Novo cjepivo, koje se naziva i Ipaina, namijenjeno zaštiti ljudi od Lassa groznice i bjesnoće, pokazalo je obećavajuće rezultate u pretkliničkim studijama, prema novoj studiji objavljenoj u znanstvenom časopisu. Inaktivirani kandidat za rekombinantno cjepivo koristi oslabljeni virus bjesnoće.

Istraživački tim umetnuo je genetski materijal virusa Lassa u vektor virusa bjesnoće kako bi cjepivo eksprimiralo površinske proteine i u Lassa i u stanicama bjesnoće. Ove površinske formulacije izazivaju imunološki odgovor protiv uzročnika infekcija. Takvo cjepivo je zatim inaktivirano kako bi "uništilo" živi virus bjesnoće koji se koristi za proizvodnju medija.

Metode dobivanja

Postoji nekoliko sustava za proizvodnju tvari. Opća metoda za proizvodnju rekombinantnog proteina temelji se na pripremi biološkog materijala iz sinteze. Ali postoje i drugi načini.

Trenutno postoji pet glavnih sustava izražavanja:

1. Sustav ekspresije oceana. Coli.
2. Sustav ekspresije kvasca.
3. Sustav ekspresije stanica insekata.
4. Sustav ekspresije stanica sisavaca.
5. Sustav ekspresije proteina bez stanica.

Potonja varijanta posebno je pogodna za ekspresiju transmembranskih proteina i toksičnih formulacija. Posljednjih godina tvari koje je teško izraziti konvencionalnim intracelularnim načinima uspješno se integriraju u stanice UMP-a. U Bjelorusiji se široko koristi priprema rekombinantnih proteina. Postoji niz državnih poduzeća koja se bave ovim pitanjem.

Sustav sinteze proteina bez stanica brza je i učinkovita metoda sinteze ciljnih tvari dodavanjem različitih supstrata i energetskih formulacija potrebnih za transkripciju i translaciju u enzimskom sustavu staničnih ekstrakata. Posljednjih godina postupno se pojavljuju prednosti acelularnih metoda takvih vrsta tvari, kako komplicirano, toksične membrane, što pokazuje njihovu potencijalnu primjenu u biofarmaceutskom području.

Tehnologija bez stanica može lako i kontrolirano dodati različite aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi kako bi se postigli složeni procesi modifikacije koje je teško riješiti nakon konvencionalne rekombinantne ekspresije. Slične metode imaju visoku vrijednost za primjenu i potencijal za isporuku lijekova i razvoj cjepiva pomoću čestica sličnih virusu. Veliki broj membranskih proteina uspješno je eksprimiran u slobodnim stanicama.

Ekspresija sastava

Rekombinantni protein AMAPINA10-AMAPIN 6 proizvodi se i primjenjuje za stvaranje cjepiva. Takav tuberkulozni alergen omogućuje vam jačanje imuniteta i razvoj antitijela. Općenito, molekularne studije uključuju proučavanje bilo kojeg aspekta proteina, kao što su struktura, funkcija, modifikacije, lokalizacija ili interakcije. Da bi istražili kako određene tvari reguliraju unutarnje procese, istraživači obično trebaju sredstva za proizvodnju funkcionalnih spojeva od interesa i koristi.

S obzirom na veličinu i složenost proteina, kemijska sinteza nije održiva opcija za ovaj pothvat. Umjesto toga, žive stanice i njihovi stanični strojevi obično se koriste kao tvornice za stvaranje i konstruiranje tvari na temelju predviđenih genetskih predložaka. Sustav ekspresije rekombinantnih proteina dalje razvija potrebnu strukturu za stvaranje lijeka. Zatim se odabire potrebno materijal za različite kategorije lijekova.

Za razliku od proteina, DNA se lako konstruira sintetički ili pomoću dobro uspostavljenih rekombinantnih tehnika. Stoga se DNK predlošci specifičnih gena, sa ili bez dodanih reporterskih sekvenci ili sekvenci afinitetnih oznaka, mogu konstruirati kao predlošci za ekspresiju promatrane tvari. Takvi sastavi dobiveni iz takvih dna predložaka nazivaju se rekombinantnim proteinima.

Tradicionalne strategije ekspresije tvari uključuju transfekciju stanica pomoću DNA vektora koji sadrži predložak, a zatim uzgoj stanica tako da transkribiraju i prevode željeni protein. Obično se stanice zatim liziraju kako bi se ekstrahirala eksprimirana formulacija za naknadno pročišćavanje. Protein rekombinantni AMAPI10-AMAPI6 obrađuje se na ovaj način i prolazi kroz sustav pročišćavanja od mogućeg stvaranja toksina. Tek tada ulazi u sintezu u cjepivo.

I prokariotski i eukariotski sustavi ekspresije molekularnih tvari naširoko se koriste. Izbor sustava ovisi o vrsti proteina, zahtjevima funkcionalne aktivnosti i željenom prinosu. Ti ekspresijski sustavi uključuju sisavce, insekte, kvasce, bakterije, alge i stanice. Svaki sustav ima svoje prednosti i izazove, a odabir pravog sustava za određenu primjenu važan je za uspješno izražavanje tvari koja se vidi u radu.

Ekspresija sisavaca

Primjena rekombinantnih proteina omogućuje razvoj cjepiva i lijekova različitih razina. Za to se može koristiti ova metoda dobivanja tvari. Sustavi ekspresije sisavaca mogu se koristiti za proizvodnju proteina iz životinjskog carstva koji imaju najoriginalniju strukturu i aktivnost zbog svog fiziološki relevantnog okruženja. To rezultira visokom razinom post-translacijske obrade i funkcionalne aktivnosti. Sustavi ekspresije sisavaca mogu se koristiti za proizvodnju antitijela, složenih proteina i spojeva za upotrebu u funkcionalnim testovima temeljenim na stanicama. Međutim, ove prednosti u kombinaciji s oštrijim uvjetima kulture.

Sustavi ekspresije sisavaca mogu se koristiti za proizvodnju proteina privremeno ili putem stabilnih staničnih linija, gdje je ekspresijski konstrukt integriran u genom domaćina. Iako se takvi sustavi mogu koristiti u nekoliko eksperimenata, privremena proizvodnja može generirati velike količine tvari u jednom do dva tjedna. Biotehnologija ove vrste rekombinantnih proteina je u velikoj potražnji.

Ovi prolazni, visoko produktivni sustavi ekspresije sisavaca koriste suspenzijske kulture i mogu proizvesti gram po litri. Nadalje, ti proteini imaju više nativnog savijanja i post-translacijskih modifikacija, poput glikozilacije, u usporedbi s drugim sustavima izrazi.

Izraz iz insekta

Metode za proizvodnju rekombinantnog proteina nisu ograničene samo na sisavce. Postoje produktivnije metode u pogledu troškova proizvodnje, iako je prinos tvari na 1 litru obrađene tekućine mnogo niži.

Stanice insekata mogu se koristiti za ekspresiju proteina visoke razine s modifikacijama sličnim sustavima sisavaca. Postoji nekoliko sustava koji se mogu koristiti za proizvodnju rekombinantnog bakulovirusa, koji se zatim može primijeniti za ekstrakciju tvari od interesa u stanicama insekata.

Ekspresije rekombinantnih proteina mogu se lako proširiti i prilagoditi kulturi suspenzije visoke gustoće za proizvodnju molekularnog spoja velikih razmjera. Oni su funkcionalnije slični izvornom sastavu tvari sisavaca. Iako prinos može biti do 500 mg / l, proizvodnja rekombinantnog bakulovirusa može biti dugotrajna i uvjeti kulture složeniji od prokariotskih sustava. Međutim, u južnijim i toplijim zemljama ova se metoda smatra učinkovitijom.

Bakterijska ekspresija

Proizvodnja rekombinantnih proteina može se uspostaviti uz pomoć bakterija. Ova se tehnologija puno razlikuje od gore opisanih. Sustavi ekspresije bakterijskih proteina popularni su jer se bakterije lako uzgajaju, brzo rastu i daju visoke prinose rekombinantnog sastava. Međutim, multidomenske eukariotske tvari izražene u bakterijama često su nefunkcionalne jer stanice nisu opremljene za obavljanje potrebnih posttranslacijskih modifikacija ili molekularnog presavijanja.

Nadalje, mnogi proteini postaju netopivi kao inkluzijske molekule, koji su vrlo teško je oporaviti bez krutih denaturatora i naknadnih glomaznih postupaka ponovnog sastavljanja molekularnog sastava. Ova se metoda uglavnom još uvijek smatra uglavnom eksperimentalnom.

Acelularna ekspresija

Rekombinantni protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu stafilokinaze dobiva se na nešto drugačiji način. Dio je mnogih vrsta injekcija, što zahtijeva nekoliko sustava prije upotrebe.

Ekspresija proteina bez stanica je sinteza supstance koja koristi ekstrakte cijelih stanica kompatibilne s translacijom. U principu, ekstrakti cijelih stanica sadrže sve makromolekule i komponente, potrebno za transkripcije, translacije, pa čak i post-translacijske modifikacije.

Te komponente uključuju RNA polimerazu, regulatorne proteinske čimbenike, transkripcijske oblike, ribosome i trna. Kada se dodaju kofaktori, nukleotidi i specifična matrica gena, ovi ekstrakti mogu sintetizirati proteine od interesa za nekoliko sati.

Iako nisu održivi za proizvodnju velikih razmjera, acelularni sustavi ili sustavi ekspresije proteina ira (ira) imaju nekoliko prednosti u odnosu na tradicionalne sustave ira.

Ekspresija bez stanica omogućuje brzu sintezu rekombinantnih sastava bez uključivanja stanične kulture. Acelularni sustavi omogućuju obilježavanje proteina modificiranim aminokiselinama, kao i ekspresiju formulacija koje se podvrgavaju brzoj proteolitičkoj razgradnji unutarstaničnim proteazama. Osim toga, lakše je istodobno eksprimirati mnogo različitih proteina metodom bez stanica (na primjer, testirati mutacije proteina ekspresijom u malom mjerilu iz mnogih različitih predložaka rekombinantne DNA). U ovom reprezentativnom eksperimentu, za ekspresiju proteina kaspaze-3, ljudi su koristili sustav IAS.

Zaključci i izgledi za budućnost

Proizvodnja rekombinantnih proteina sada se može smatrati zrelom disciplinom. To je rezultat brojnih postupnih poboljšanja u čišćenju i analizi. Trenutno se programi otkrivanja lijekova rijetko zaustavljaju zbog nemogućnosti proizvodnje ciljanog proteina. Paralelni procesi za ekspresiju, pročišćavanje i analizu nekoliko rekombinantnih tvari danas su dobro poznati u mnogim laboratorijima širom svijeta.

Proteinski kompleksi i sve veći uspjeh u stvaranju otopljenih membranskih struktura zahtijevat će više promjena kako bi išli u korak s potražnjom. Pojava učinkovitih ugovornih istraživačkih organizacija za redovitiju opskrbu proteinima omogućit će preraspodjelu znanstvenih resursa za rješavanje ovih novih izazova.

Uz to, paralelni tijekovi rada trebali bi omogućiti izgradnju cjelovitih biblioteka pregledanih tvari kako bi se omogućila identifikacija novih ciljeva i napredni probir, zajedno s tradicionalnim projektima otkrivanja lijekova na bazi malih molekula.